最近经常有同学和小尚反映细胞复苏困难。细胞复苏是细胞培养中的一个常规操作，但其中的许多细节常被忽视。复苏的成功与冻存、复苏操作密切相关，稍有不慎可能导致严重后果。本文主要从冻存的角度进行分析，后续将更新复苏操作的原因排查，欢迎同学们收藏关注。

冻存步骤复习

在进行细胞冻存前，我们需要复习一下冻存的基本步骤：
1. 提前准备好冻存液；
2. 离心获得细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞；
3. 将细胞悬液转移至冻存管；
4. 如果使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒中，并置于-80℃冰箱过夜后再转入液氮保存；如使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

冻存常见错误操作

南宫28建议注意以下几个常见错误：
1. 使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，未使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快会形成冰晶，导致细胞破裂死亡。常规冻存液需要搭配冻存盒使用，市面上的程序冻存盒能确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。无法使用冻存盒的同学，可将冻存管置于泡沫盒中，在4℃静置5-10分钟，随后在-20℃静置2小时后转入-80℃过夜，第二天再转入液氮保存。若没有泡沫盒，建议使用无血清非程序冻存液，该液体含有更多保护剂，冻存时可直接重悬细胞并冷藏于-80℃过夜后再转入液氮。

2. 冻存前细胞状态不佳或冻存密度偏低。细胞的健康状态是复苏成功的前提，需选择对数生长期、汇合度在80%以上的细胞进行冻存。若冻存前细胞培养上清呈橘黄色，建议换液后静置培养4小时再进行冻存。尽管冻存液含有保护剂，但冷冻过程中会有少量细胞死亡，因此冻存密度不宜过低，推荐在200-300万/mL/管。如不易计数，可参考一个T25瓶冻存1-2管，以及一个10cm皿冻存2-3管（细胞需保持在80%以上汇合度）。

3. 未提前配制冻存液，直接将DMSO加入细胞悬液。DMSO被稀释时会放热，可能对脆弱的细胞造成损伤。虽然一些细胞可能无大碍，但为了确保科研课题顺利，建议先配制好冻存液，再进行细胞处理。

4. 冻存液重悬细胞后直接放入液氮。液氮的温度为-196℃，若细胞未经梯度降温直接放入，细胞必然会死亡。也并不建议将细胞放在液氮罐口降温。

5. 冻存液配方不合适。研究显示5%-10%的DMSO最适合细胞冻存，具体比例需根据细胞种类调整。对于对DMSO敏感的细胞，需降低比例。根据南宫28的经验，8% DMSO适用于大多数细胞系。同时，还需根据细胞培养难度调整血清比例，越难养的细胞越需要提高血清浓度，脆弱的细胞可用血清+DMSO冻存，而不加培养基。无论哪种冻存液，建议进行冻检后再正式冻存，即冻存24小时后复苏一支以确认细胞状态良好，然后进行大批量冻存。在冻检成功前，必须保留至少一瓶细胞培养，以防复苏失败导致细胞绝种。

6. 冻存条件不当或冻存时间过长。通常，液氮储存的时限和稳定性大大优于-80℃冰箱。-80℃冰箱由于频繁开关门，温度不够稳定，导致细胞活率迅速下降，因此尽量采用液氮保存。若没有液氮罐的同学，可将冻存管放在-80℃冰箱的内部位置，并定期进行复苏检测以确认细胞活性。

未完待续。