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南宫28细胞复苏失败原因分析——冻存篇

来源:欧馥寒 日期:2025-02-09

最近经常有同学和小尚反映细胞复苏困难。细胞复苏是细胞培养中的一个常规操作,但其中的许多细节常被忽视。复苏的成功与冻存、复苏操作密切相关,稍有不慎可能导致严重后果。本文主要从冻存的角度进行分析,后续将更新复苏操作的原因排查,欢迎同学们收藏关注。

南宫28细胞复苏失败原因分析——冻存篇

冻存步骤复习

在进行细胞冻存前,我们需要复习一下冻存的基本步骤:
1. 提前准备好冻存液;
2. 离心获得细胞沉淀后,加入冻存液轻轻重悬细胞;
3. 将细胞悬液转移至冻存管;
4. 如果使用程序冻存液,将冻存管放入程序冻存盒中,并置于-80℃冰箱过夜后再转入液氮保存;如使用非程序冻存液,则无需冻存盒。

冻存常见错误操作

南宫28建议注意以下几个常见错误:
1. 使用常规含血清冻存液(培养基+血清+DMSO)时,未使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快会形成冰晶,导致细胞破裂死亡。常规冻存液需要搭配冻存盒使用,市面上的程序冻存盒能确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。无法使用冻存盒的同学,可将冻存管置于泡沫盒中,在4℃静置5-10分钟,随后在-20℃静置2小时后转入-80℃过夜,第二天再转入液氮保存。若没有泡沫盒,建议使用无血清非程序冻存液,该液体含有更多保护剂,冻存时可直接重悬细胞并冷藏于-80℃过夜后再转入液氮。

2. 冻存前细胞状态不佳或冻存密度偏低。细胞的健康状态是复苏成功的前提,需选择对数生长期、汇合度在80%以上的细胞进行冻存。若冻存前细胞培养上清呈橘黄色,建议换液后静置培养4小时再进行冻存。尽管冻存液含有保护剂,但冷冻过程中会有少量细胞死亡,因此冻存密度不宜过低,推荐在200-300万/mL/管。如不易计数,可参考一个T25瓶冻存1-2管,以及一个10cm皿冻存2-3管(细胞需保持在80%以上汇合度)。

3. 未提前配制冻存液,直接将DMSO加入细胞悬液。DMSO被稀释时会放热,可能对脆弱的细胞造成损伤。虽然一些细胞可能无大碍,但为了确保科研课题顺利,建议先配制好冻存液,再进行细胞处理。

4. 冻存液重悬细胞后直接放入液氮。液氮的温度为-196℃,若细胞未经梯度降温直接放入,细胞必然会死亡。也并不建议将细胞放在液氮罐口降温。

5. 冻存液配方不合适。研究显示5%-10%的DMSO最适合细胞冻存,具体比例需根据细胞种类调整。对于对DMSO敏感的细胞,需降低比例。根据南宫28的经验,8% DMSO适用于大多数细胞系。同时,还需根据细胞培养难度调整血清比例,越难养的细胞越需要提高血清浓度,脆弱的细胞可用血清+DMSO冻存,而不加培养基。无论哪种冻存液,建议进行冻检后再正式冻存,即冻存24小时后复苏一支以确认细胞状态良好,然后进行大批量冻存。在冻检成功前,必须保留至少一瓶细胞培养,以防复苏失败导致细胞绝种。

6. 冻存条件不当或冻存时间过长。通常,液氮储存的时限和稳定性大大优于-80℃冰箱。-80℃冰箱由于频繁开关门,温度不够稳定,导致细胞活率迅速下降,因此尽量采用液氮保存。若没有液氮罐的同学,可将冻存管放在-80℃冰箱的内部位置,并定期进行复苏检测以确认细胞活性。

未完待续。

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